واكنش زنجيره اي پلي مراز
PCRروشي ساده و سريع براي ساخت نسخه هاي متعددي از توالي هاي حدود يك كيلو بازي(1Kb) DNAمي باشد (شكل 8ـپ) . PCRبه صورت روشي براي آماده سازي وتحليل ،به طور گسترده در همه شاخه هاي بيو لوژي مولكولي استفاده مي شود . در اين روش لازم است كه ترتيب نوكلئوتيدي نواحي كوچكي از DNA كه در طرفين قطعه اي را كه مي خواهيم تكثير كنيم، بدانيم .
با توجه به اين تواليهاي كناري ،نوكلئوتيدهاي پرايمر تعيين مي شوند . روش واكنش زنجيره اي پلي مراز از چرخه هاي متوالي ذوب ، سرد كردن و سنتز DNA تشكيل شده است (شكل 8ـپ ) . DNAدو رشته اي كه توالي مورد نظر را دارد با غلظت زيادي از دو نوع اوليگونوكلئوتيد DNAتك رشته اي (پرايمرها )مخلوط مي شود .پرايمر اول مشابه انتهاي ّ5 زنجيره اصلي ـ همان زنجيره اي از DNAكه بايد كپي شود ـ بوده وپرايمر دوم مشابه انتهاي ّ3 زنجيره مكمل از همين DNA مي باشد . با توجه به اين كه مولكولهاي DNA ، ساختار دو رشته اي و موازي ولي معكوس دارند پرايمر دوم مكمل ومعكوس زنجيره اصلي نيز مي باشد . واكنش PCR با ذوب (جدا شدن )DNA دو رشته اي در دماي بالا آغاز مي شود وبه دنبال آن سرد مي شود . در هنگام سرد كردن ، آغازگر (پرايمر ) اول ـكه به فراواني يافت مي شود ـ با انتهاي ّ3 زنجيره مكمل و پرايمر دوم ـ كه آن هم به فراواني در محيط آزمايش وجود دارد ـ با انتهاي ّ3زنجيره اصلي متصل مي شود . مخلوط سرد شده (كه در آن پرايمرها به DNA متصل شده اند )در مجاورت DNA پلي مراز يك و چهار نوع دزاكسي نوكلئوتيد تري فسفاتي كه براي ساخت مولكول DNAلازم هستند (A,G,T,C) قرار مي گيرد وساخت مولكولهاي جديد DNA صورت مي پذيرد . DNAپليمراز يك با ساختن زتجيره اي مكمل از مولكولهاي DNA تك رشته اي الگو ،به سمت ّ3 هر يك از پرايمرهاي متصل شده ،شروع به پيشروي مي نمايد .زنجيره هاي اصلي و مكمل هر يك به طور اختصاصي به صورت الگويي براي ساخت زنجيره مكمل خود و زنجيره جديد عمل مي كنند ؛ نخستين چرخه در اينجا به پايان مي رسد .
چرخه دوم با ذوب مجدد مخلوط قبلي شروع مي شود و به دنبال آن مخلوط در حضور پرايمرها سرد مي شود و بدين ترتيب پرايمرها به DNA متصل مي شوند .
در مرحله ساخت DNA از چرخه دوم هر كدام از زنجيره هاي ساخته شده در چرخه اول ضمن هيبريد شدن با پرايمر مناسب به صورت الگو (علاوه بر زنجيره هاي DNA اوليه ) عمل مي كنند ، يعني تعداد قالب هاي اين واكنش در هر چرخه دو برابر مي شوند و به همين دليل است كه به اين روش ، واكنش زنجيره اي پلي مراز (PCR) گفته مي شود . چرخه دوم با طويل شدن پرايمر وساخته شدن مكمل از الگوها با اثر DNA پلي مراز يك تكميل مي شود . واكنش هاي PCR را مي توان حداقل در بيست چرخه و يا بيشتر ادامه داد كه طي هر چرخه توالي هايي كه از دو طرف به پرايمر محدود مي شوند ، دو برابر خواهند شد . با استفاده از دستگاههاي تنظيم چرخه هاي حرارتي ( ترمو سايكلر ) مي توان ذوب ، سرد كردن ( مرحله اتصال پرايمر ها ) و مرحله ساخت DNA را به طور خودكار كنترل نمود . البته در چنين شرايطي از آنزيم DNA پلي مرازي (DNAپلي مراز يك ) كه از باكتري هاي مقاوم به حرارت تهيه مي شود ـ دماي زياد لازم براي ذوب DNA را تحمل مي كنند ـ استفاده مي شود كه واكنشها خود به خودي و خودكار شوند .
PCRكاربردهاي فراواني دارد ،به طور مثال با انتخاب پرايمرهاي مناسب مي توان اگزون دوم آلل ناشناخته اي از زنجيره بتا در جايگاه ژني HLA_DRرا ـكه دامين پروتئيني پلي مورفيك در ناحيه بتا يك را رمز دهي مي كندـ تكثير نمود.سپسمي توان DNAحاصل را به ناقل مناسب انتقال داد و توالي آنرا بدون جدا كردن ژن اصلي از DNAژنوم شناسايي نمود .ابتدا نيز واكنش زنجيره اي پلي مراز براي چنين هدفي ابداع شد .همچنين از روش PCR براي شبيه سازي (همانند سازي)ژنهاي شناخته شده يا ژنهاي مرتبط به ژنهاي شناخته شده استفاده مي شود،براي اين كار آغاز گرها (پرايمرها)را براي نواحي ثابت يك خانواده ژني انتخاب مي كنند .از PCR مي توان براي تشخيص حضور تواليهاي خاصي از DNAدر يك نمونه (به طور مثال وجود تواليهاي ويروسي خاصي در نمونه هاي باليني )وحتي گاهي سنجش مقدار آن نيز استفاده نمود .هر گاه پيش از تكثيرDNAبا روش PCR،با استفاده از آنزيم رونوشت برداري معكوس (RT)نسخه cDNAاز mRNAتهيه شود ،با اين روش ميزان mRNA در محيط نيز قابل اندازه گيري است .بدليل آنكه در روش PCRفقط در صورت نزديكي دو پرايمر به هئديگر (يعني دارا بودن فاصله اي معادل يك كيلو باز)تكثيرDNAامكان پذير مي شود،با استفاده از پرايمرهايي كه توالي مكمل ژنهايي باشند كه با باز آرايي ژني در مجاورت يكديگر قرار گرفته اند،مي توان ميزان بازآرايي ژن خاص را نيز ارزيابي كرد(به طور مثال توالي نوكلئوتيدي در ژنهاي خاصي از ناحيه متغير (V)و(J) در ژنهاي ايمونوگلوبولين ) .
