استخراج DNA از بافت گیاهی
استخراج DNA از بافت گیاهی
روش کلی استخراج ماده وراثتی جهت انجام فعالیت های پژوهشی و اصلاحی در گیاهان به شرح زیر میباشد.
TESS (1- اول بافر
کد:
A: Tris NaoH( or HCl )………..100 mM
B: EDTA………………………..1mM
C: NaCl…………………………50mM
D: SDS…………………………2%
2- حدود 3 گرم بافت برگ گياه در ازت مايع با هاون خرد شود.
3- مقداري از بافت خرد شده (حدود 2/0 گرم ) را داخل تيوب 5/1 سي سي ريخته و به آن ( 1/0 تا 3/0 حجم تيوب ) اضافه مي كنيم. TESS 500 ميكروليتر بافر استخراج
4- به مدت 10 دقيقه در دماي اتاق روي شيكر به هم بخورد.
5- بعد از هم خوردن به مدت 10 دقيقه به آن 150 ميكروليتر استات پتاسيم 5 مولار اضافه مي كنيم و دوباره روي شيكر به مدت 5 دقيقه قرار مي دهيم (در دماي اتاق).
6- بعد از به هم خوردن سانتريفيوژ تيوبها به مدت 4 دقيقه و با سرعت 7000 دور انجام مي گيرد.
7- بعد از سانتريفيوژ، فاز رويي تيوپ را به تيوپ جديد منتقل كرده و رسوب بافت گياهي را از آن حذف مي كنيم.
8- به فاز رويي سانتريفيوژ در تيوپ جديد، هم اندازه حجم خود آن الكل 96% اضافه كرده و به آرام چند بار به هم زده تا باهم مخلوط شده و بعد به مدت 20 دقيقه در فريزر 20- قرار مي دهيم.
9- در مرحله بعد، از فريزر بيرون آورده و سانتريفيوژ دوم آنرا با 14000 دور و مدت 6 دقيقه انجام مي دهيم.
در ته تيوپ را باDNA10- بعد از اتمام سانتريفيوژ فاز رويي را سريعا" خالي كرده و پليت اتانول
70% شستشو مي دهيم ( هر بار با 100 ميكرو ليتر).
11- بعد از شستشو سر تيوبها را به مدت نيم ساعت باز گذاشته تا خشك شوند و بعد به هر يا آب مقطر اضافه مي كنيم.TE كدام از آنها 100 ميكروليتر بافر
http://prunus.blogfa.com/cat-4.aspx
