تعيين مقدار آنتي ژن با روش هاي سنجش ايمني(ايمونواسي)
روش هاي ايمونولوژيك تعيين غلظت آنتي ژن، بسيار حساس و اختصاصي هستند و در هر دو زمينه تحقيقاتي و باليني روش هاي معتبري مي باشد. همه روش هاي ايمونوشيميايي نوين كه براي سنجش كمي آنتي ژن كاربرد دارند،بر اساس حضور آنتي ژن يا آنتي بادي خالص استوار است كه مقدار آن را با مولكولي نشاندار (معرف) مي توان اندازه گيري نمود.پس از نشاندار كردن مولكول ها با غناصر راديو ايزوتوپ (آنتي بادي يا آنتي ژن) ،ميتوان در محيط آزمايش مقدار مولكول هاي نشاندار را با دستگاههايي كه پرتو هاي ساطع شده از ماده راديو اكتيو را اندازه گيري مي كنند ، سنجش نمود. اين روش آزمايشگاهي را كه سنجش ايمني با ماده راديو اكتيو (RIA) نام دارد اولين بار روزالين يالو معرفي كرد. همچنين با اتصال مولكول معرف به آنزيم با پيوند هاي كووالان و سنجش ميزان تبديل سوبستراي بي رنگ به فرآورده رنگي نيز مي توان مقدار مولكول هاي موجود در هر مايع بيولوژيك را اندازه گيري نمود.اين كار با كمك دستگاه اسپكتروفتومتري و رنگ سنجي محصول انجام مي شود. نام اين روش اليزا (ELISA)يا سنجش ايمني با آنزيم در سطح جامد است. براي تعيين مقدار كمي آنتي ژن در نمونه هاي آزمايشگاهي روشهاي متعددي از RIAوELISAموجود است ،ليكن رايج ترين و حساس ترين آنها ،روش ساندويچ است (شكل1ـپ).در روش سا ندويچ از دو آنتي بادي مختلف كه هر دو با آنتي ژن مورد نظرـ كه مقدار آن بايد اندازه گيري شود ـ با ترتيب خاص واكنش مي دهند ،استفاده مي شود .مقدار معيني از آنتي بادي (آنتي بادي اختصاصي مرحله اول)را به كف چا هك هاي ميكرو پليت پلاستيكي متصل مي كنند .سپس محلول مورد آزمايش كه حاوي غلظت نا مشخصي از آنتي ژن است يا چند نمونه با غلظت مشخص آنتي ژن (نمونه هاي استاندارد )را در هر چاهك مي ريزند .مدتي صبر مي كنند كه واكنش آنتي ژن ـآنتي بادي انجام شود و با شستشو ،آنتي ژنهاي متصل نشده و مواد نا خوا سته را از محيط خا رج مي كنند.حال دومين آنتي بادي (آنتي بادي مرحله دوم) را كه با ماده راديواكتيو يا آنزيم،نشاندار شده را اضافه مي كنند كه به آنتي ژن اتصال يابد. در اين روش آنتي ژن مانند پلي عمل مي كند. بنابراين هر چه آنتي ژن بيشتري در محلول مورد آزمايش يا محلول استاندارد موجود باشد ميزان بيشتري از دومين آنتي بادي (آنتي بادي مرحله دوم) ـكه با آنزيم يا ماده راديواكتيو نشاندار شده است ـ متصل خواهد شد . با استفاده از نتايج حاصل از انجام اين بررسي در محلولهاي استاندارد ، مي توان منحني اتصال آنتي بادي نشاندار را بر حسب غلظت آنتي ژن رسم نمود و ميزان آنتي ژن موجود در محلول مورد آزمايش را از منحني محاسبه نمود. به دليل آنكه در اين روش ها از دو نوع آنتي بادي مونوكلونال اختصاصي استفاده ميشود ، لازم است كه اين دو آنتي بادي شاخص هايي از آنتي ژن را شناسايي كنند كه با يكديگر همپوشاني نداشته باشند :وگرنه دومين آنتي بادي ها (آنتي بادي نشاندار) به آنتي ژن متصل نخواهد شد. در روش ايمونولوژيك ديگر كه بر اساس اتصال آنتي باديها انجام مي شود و از اهميت باليني بسياري نيز برخوردار است ، نمونه بيمار را به منظور يافتن آنتي باديهاي اختصاصي عليه آنتي ژن ميكروبي (نظير آنتي باديهاي ضد بعضي پروتئين هاي ويروس هاي HIVيا HBV) كه نشانه از حضور عفونت مي باشند ، مورد بررسي و تجسس قرار مي دهند.در اين روش مقداري از آنتي ژن را تا سر حد اشباع به چاهك هاي متوالي كه بيشتر آنتي بادي اختصاصي به كف آنها متصل شده اضافه مي كنند.البته احتمال دارد كه آنتي ژن را بدون واسطه به كف چاهك متصل كنند ،سپس سرم بيمار را كه به طور متوالي رقيق كرده اند به ترتيب به هر چاهك اضافه مي كنند. سپس صبر مي كنند كه اگر آنتي بادي اختصاصي وجود دارد به آنتي ژن كف چاهك متصل شود.در مرحله آخر پس از شستشو ،آنتي بادي ثانويه ضد ايمونوگلوبولين انساني كه با ماده راديواكتيو يا آنزيم نشاندار شده است را اضافه مي كنند و با توجه به واكنش ايجاد شده ،به مقدار آنتي بادي اختصاصي در سرم بيمار پي مي برند.
